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三代测序（SMRT Sequencing）
目前主流三代测序平台除了Oxford 家的 Nanopore，还有 Pacific Biosciences（简称 PacBio）公司的 Single Molecule Real-Time（SMRT）Sequencing。 该平台的优势在于：
- 在不会影响吞吐量和准确性的前提下，提供目前最长的读取长度
- 如果不含系统误差，准确度可达 99.999％
- 可测取富含AT或GC区域，高度重复序列，回文序列等，不会产生GC的较大偏差
- 可以直接测取化学修饰，在表观遗传学中有重要应用
吃个瓜，2018年11月1日，Illumina 同意以12亿美元现金收购 PacBio 和其三代测序技术。
但是，今年Illumina放弃了收购计划，摊手。
一、基本原理
边合成边测序，与前文我们说的 Illumina 的基本测序原理一样。
二、构建文库
将样本中的DNA或RNA分子提取后，构建如下的哑铃状分子结构：
- 黄色，紫色：双链DNA分子
- 蓝色：接头（Adapter）
将文库分子展开，一个完整的圆环出现在我们眼前：
这种结构有利于进行周而复始的滚环复制，我们后文会讲这种复制方式的好处。
将样本中所有的DNA片段都构建哑铃状分子结构，组成的集合就叫文库（SMRTbell Library），随后，它们会被放到测序芯片中。
三、测序芯片
以 RSII 测序平台为例，测序仪芯片（SMRT Cell）长这样：
放大后：
上面整齐排列着15万个直径为70纳米的测序微孔（Zero-Model Waveguides，ZMWs）。
四、上机测序
1、构建测序复合物
测序复合物：聚合酶，测序模板，测序引物
2、复合物撒入测序小孔
3、固定测序复合物
由于聚合酶加了生物素，在芯片玻璃底板有链酶亲和素。利用生物素和链酶亲和素的亲和力，包含聚合酶的测序复合物会被固定在玻璃底板。
4、构建带有荧光基团的dNTP
在芯片溶液中含有许多游离dNTP，所谓游离dNTP就是随机飘在溶液中的dNTP。
ATGC四种碱基的dNTP，在磷酸基团上分别带有四种颜色的荧光基团。
5、边合成边测序
在合成时，游离的dNTP被固定在底板上的酶捕获，激发光会从玻璃板底部发出。
怎么保证每次测取一个碱基？
由于测序小孔直径很小，激发光的穿透能力会逐渐衰减，只能在小孔中传输很短的距离，所以只有当dNTP足够靠近底部，荧光基团才会被激发光照到，发出荧光。当然，其他的游离dNTP，虽然也有可能飘到小孔底部被激发光照到，但这种情况极少。
在一个碱基合成结束后，带有荧光基团的磷酸基团会从dNTP上掉落，发生猝灭，不影响其他碱基的信号检测。
在发生测序的小孔有各自的DNA片段和测序复合物，同一时间发出不同颜色的激发光，机器会检测到如下的光信号，实际同时会得到多达几万个光点。
重复上述步骤，经过计算机分析光谱，最终我们拿到样本的测序文件。SMRT Sequencing 测序过程中，每秒读取三个碱基，一个小时可检测大约一万多碱基。
6、检测碱基甲基化
有意思的是，在SMRT Sequencing测序过程中，可以直接测到碱基被修饰的状态，聚合酶遇到碱基上带有甲基化的碱基，合成速度会明显变慢，而且光谱也会发生改变。
因此，SMRT Sequencing 可以检测到碱基的甲基化修饰情况。
五、测序模型
SMRT 测序有如下两种测序模式：
1、Circular Consensus Sequencing (CCS)
说这种测序模型前，就不得不提三代测序最大的缺点：碱基读取不准，错误率在12.5%，也就是说，每读取八个碱基，就会读错一个。
好在碱基读取错误是随机的，如果重新读一遍同样位置的碱基，不一定会发生同样的错误。
如果对同一个序列，多测几遍，那么这些读错的碱基就能矫正过来。
前边提到的滚环复制的优势就来了，我们可以利用测序复合物在环状文库分子循环测序同一个片段来消除错误率。
这种测序模型，复制出的 Reads叫 HiFi Reads，测序准确率 > 99%。
2、Continuous Long Read (CLR) Sequencing
这种测序的优势在于可以读取更长的 Reads。
六、其他影响因素
1、GC bias 影响
什么是 GC bias？
PCR 时，如果模板里的G、C碱基含量高，PCR效率低，A、T碱基含量高，PCR效率高。一般测序过程，如二代测序，都会有大量的PCR过程。这样就会有一个问题，G、C含量高的片段，读到的 Reads 数少。
SMRT 在测序过程中，没有 PCR 过程，因此富含GC含量高，含量低的 Reads 片段都会有相似的概率被测序，所以三代测序中的 GC Bias 影响小。
2、读长的限制因素
- DNA模板断裂，用激发光长时间照射DNA链时，会发生断裂，DNA链会从酶上掉下来，测序终止。
- 酶变性，酶被长时间照射时，酶会变性，失去聚合酶活性，测序终止。
- 文库序列短，如果做文库序列片段大于 20~30 K ，且保证质量的文库是有技术难度的
3、测序通量
目前，主流的测序平台有三种，各有利弊，可以根据自己的课题来选择。
以RSII为例，将测序复合物，随机撒到15万个小孔中，正好有一个复合物进入到单个小孔的概率符合泊松分布。理论情况是
- 1/3 的小孔中有一个测序复合物，正常信号
- 1/3 的小孔什么都没有，无信号
- 1/3 的小孔中有两个以上的测序复合物，杂乱信号
五万个小孔 * 10kb，所以一张芯片大约会产出500M的数据。
参考：
https://www.youtube.com/watch?v=lD8JyAbwEo
https://www.youtube.com/watch?v=rUKhfITd2CA
https://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc&t=1s
编辑于 03-03
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