RNA-seq——三、使用Hisat2进行序列比对_hisat2与count如何选择人类基因组序列比对文件-程序员宅基地

技术标签： samtools  生信学习  hisat2  sam  bam  

步骤

为什么要比对：https://www.jianshu.com/p/681e02e7f9af

Jimmy老师主要演示了四种比对工具，分别为hisat2、subjunc、bowtie2、bwa。除了subjunc能够直接生成bam文件外，这些软件的用法都很相似。需要根据自己的需求来选择对应的软件。
这里以使用hisat2为例。

1. 下载对应的index

为什么要下载index：https://www.jianshu.com/p/681e02e7f9af

Hisat2官网下载：https://daehwankimlab.github.io/hisat2/download/
挂了梯子，使用edge浏览器，一小时左右下完。之后再导入服务器，再花一小时，淦！！！
在这里插入图片描述
解压文件

tar -zxvf hg19_genome.tar.gz
tar -zxvf mm10_genome.tar.gz

看一下里面都有什么
在这里插入图片描述

2. 序列比对

# 激活环境
conda activate rna

# -p 设置线程
# -x 参考基因组索引文件的前缀
# -U 单端测序文件
# -S 指定输出文件
hisat2 -p 10 -x ./hg19/genome -U ../sra/SRR957677.fastq.gz -S ../aligned/SRR957677.sam

在这里插入图片描述

一次比对多个文件的例子：https://www.jianshu.com/p/479c7b576e6f

# 双端测序数据
# -t 显示比对时间
# -1 双端测序结果的第一个文件
# -2 双端测序结果的第二个文件

# 人的比对
for ((i=56;i<=58;i++));do hisat2 -t -x /mnt/f/rna_seq/data/reference/index/hg19/genome -1 /mnt/f/rna_seq/data/SRR35899${
    i}.sra_1.fastq.gz -2 /mnt/f/rna_seq/data/SRR35899${
    i}.sra_2.fastq.gz -S SRR35899${
    i}.sam ;done
# 小鼠比对
$ for ((i=59;i<=62;i++));do hisat2 -t -x /mnt/f/rna_seq/data/reference/index/mm10/genome -1 /mnt/f/rna_seq/data/SRR35899${
    i}.sra_1.fastq.gz -2 /mnt/f/rna_seq/data/SRR35899${
    i}.sra_2.fastq.gz -S SRR35899${
    i}.sam; done

3. samtools：将sam文件转为bam文件

sort 默认按照染色体位置进行排序
-n 根据read名进行排序
-t 根据TAG进行排序
参考：https://www.jianshu.com/p/681e02e7f9af

详细参数解释见：使用SAMtools将SAM文件转换为BAM文件、排序、建立索引

# -O 设置最终输出的文件格式，可以是bam，sam或者cram，默认为bam
# -@ 设置线程，加快运行速度
# -o 设置最终排序后的输出文件名
samtools sort -O bam -@ 2 -o SRR957677.bam SRR957677.sam

# 必须对bam文件进行默认情况下的排序后，才能进行index，否则会报错。
# 建立索引后将产生后缀为.bai的文件，用于快速的随机处理。
samtools index SRR957677.bam
samtools view SRR957677.bam | less -SN

# 给出BAM文件的比对结果
samtools flagstat -@ 2 SRR957677.bam

在这里插入图片描述
在这里插入图片描述
这里比对结果异常，应该是使用的数据为单端测序数据造成的。

一次转换多个文件的例子：https://www.jianshu.com/p/479c7b576e6f

# 首先将比对后的sam文件转换成bam文件
# 利用的是samtools的view选项，参数-S 输入sam文件；参数-b 指定输出的文件为bam；最后重定向写入bam文件
$ cd mnt/f/rna_seq/aligned
$ for ((i=56;i<=62;i++));do samtools view -S SRR35899${
    i}.sam -b > SRR35899${
    i}.bam;done
# 将所有的bam文件按默认的染色体位置进行排序
$ for ((i=56;i<=62;i++));do samtools sort SRR35899${
    i}.bam -o SRR35899${
    i}_sorted.bam;done
# 将所有的排序文件建立索引，索引文件.bai后缀
$ for ((i=56;i<=62;i++));do samtools index SRR35899${
    i}_sorted.bam;done

Jimmy老师的方法

ls *.sam | while read id; do (samtools sort -O bam -@ 5 -o $(basename ${
    id} ".sam").bam ${
    id}); done
ls *.bam | xargs -i samtools index {
    }

ls *.bam | while read id; do (samtools flagstat -@ 10 $id > $(basename ${
    id} ".bam").flagstat); done

4. 将bam文件载入IGV

将bam文件导入igv，在chr位置输入":10039"，结果如图。看不懂…
在这里插入图片描述
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